本文介绍了一种专为液相色谱应用设计的新型实时液芯拉曼波导检测器。与典型的高效液相色谱（HPLC）检测器相比，拉曼波导检测器具有更高的选择性。波导检测器还极大地提高了典型拉曼测量的灵敏度，而无需采用表面增强或共振方法，并且与微孔和小孔 HPLC（填充 1-2 毫米内径色谱柱）洗脱的典型峰宽体积兼容。使用液芯波导技术的拉曼池测量水相中的醇类，检测限提高了 1000 倍以上。本研究中演示的液芯波导采用折射率为 1.29 的 Teflon AF 2400 管材构建（富临塑胶供应Teflon AF 2400 管材）。聚合物材料的低折射率使得可以使用水性流动相进行具有拉曼检测的 HPLC 分离。生成了 2-丙醇水溶液的校准曲线，并确定了 2 ppm 的检测限 (LOD)。拉曼波导检测器经过验证可用于酒精测试混合物的 HPLC 分析，检测器的 LOD 处于低 ppm 范围内。通过将 HPLC 实现的时间分离与拉曼检测收集的振动信息相结合，可以获得信息丰富的多元数据矩阵，即使在 HPLC 分辨率较差的情况下，也可以对其进行解卷积以提供化学形态。在本文中，我们将讨论拉曼波导检测器的物理和光学设计以及用于 HPLC 检测的检测器的演示。
拉曼光谱是一种强大的工具，可为复杂基质中的单个化合物提供结构信息定性。然而，拉曼光谱作为高效液相色谱 (HPLC) 的定性和定量分析检测器的应用因其固有的灵敏度缺乏而受到限制。拉曼散射是一种非常微弱的现象； 大约每10^(7)个光子中只有1个光子的散射频率与源辐射的频率不同。目前用于增强拉曼测量灵敏度的技术包括表面增强拉曼光谱 (SERS) 和共振拉曼光谱 (RRS)。这两种技术都有助于提高拉曼测量的灵敏度；然而，这些方法特异性强，难以应用于常规分析，并且通常不适合定量分析。虽然 HPLC 是一种流行且强大的分析工具，但 HPLC 的应用范围始终受到检测器提供的化学选择性和灵敏度的限制。本文描述的工作旨在解决 HPLC 拉曼检测领域的这一局限性。拉曼检测与 HPLC 的有效耦合取决于与 HPLC 峰宽体积兼容的流动池的正确设计，以及拉曼检测所需的最佳池几何形状。此外，流通池必须与水溶液兼容，因为许多 HPLC 应用是在反相模式下进行的，使用含有有机改性剂的水作为流动相。
科学家于 1928 年首次认识到使用增加样品路径长度的样品池来提高拉曼信号强度。从那时起，人们做了大量工作来开发液芯波导，以增强紫外可见光、荧光和拉曼光谱中的信号。液芯波导可以由壁材料具有比芯材料低的折射率的任何管材制成。在这些物理条件下，以适当的角度发射到芯中的光可以通过全内反射以最小的损耗在管中传播或波导。由于这种波导现象，可以设计长光程光学单元，增加激发的分子数量，从而提高拉曼散射效率并促进收集。
Walfaren 和 Stone 是第一个开发出有效的液芯波导来增强拉曼信号的人。他们报道了在 10-25 m 的液体填充石英管中，各种有机溶剂（包括苯和四氯乙烯）的拉曼信号增强了 10²-10³。Ross 和 McClain 还报道了使用填充液体的石英纤维来增强拉曼光谱，以测量苯中的反式二苯乙烯。Schwab 和 McCreery 是第一个报告使用光纤耦合液芯波导来增强水溶液拉曼信号的人。他们的 1 米长抛光石英波导传感器采用光纤束（围绕 1 个激发进行 18 个收集），实现信号增强 30-50 倍。Benoit 和 Yappert 报告称，使用双光纤（1 个激发/1 个收集）抛光石英拉曼波导来分析水溶液，信号增强了 70 倍。使用抛光石英管波导进行水溶液测量的一个缺点是波导是在玻璃/空气界面而不是玻璃/溶液界面处形成的。由于玻璃表面污染（即灰尘、指纹等），这会导致波传播问题和光损失。另一个缺点是激光通过溶液和石英管传播，这会导致动态流动系统中的信号变化（由于折射率的变化）以及由于石英管而产生大的拉曼信号。
一直以来，由于缺乏折射率低于水的材料（nd 1.33），使用长光程光学池来测量水溶液是不可能的。然而，由于Teflon AF 2400管材的出现，推动了液芯波导在水相光谱学中的应用。该材料 Teflon AF（2,2-双（三氟甲基）-4,5-二氟-1,3-二氧杂环戊烯）是一种折射率为 1.29-1.31 的无定形含氟聚合物（富临塑胶供应Teflon AF 2400管材）。它的独特之处在于它具有极低的折射率、高透气性和低导热性。由Teflon AF 2400管材的商业化带动了用于通过紫外-可见光、荧光和拉曼光谱分析水系统的液芯波导的发展。
以前，HPLC 洗脱液的拉曼分析是通过将流量转移到离线采样池来进行的。在这种静态条件下，使用高功率激光和长积分时间来检测和识别浓度低至 10^(-5) mol/L 的二甲苯异构体。现在使用直接与商用 HPLC 仪器耦合的 Teflon AF 波导吸光度池，可将水中各种环境污染物的检测限提高 30-50 倍。HPLC/Raman 的更广泛应用需要使用简单且经济实惠的仪器进行动态在线采样和实时数据采集。
在本文中，我们描述了一种新型波导检测单元，用于对流动系统（特别是反相 HPLC）进行灵敏的拉曼测量。通过将拉曼波导池数据与 2-丙醇 (IPA) 的典型拉曼测量数据进行比较，证明了拉曼池的定量性能。2-丙醇和其他分析物的信号显着增强并提高了检测限 (LOD)。通过将检测器与微孔 HPLC（2-mmi.d. 填充柱）系统耦合来证明拉曼波导池的定性性能。将 HPLC 分离与实时拉曼光谱检测相结合，可以对复杂混合物进行阳性识别和定量，而无需进行基线分离。HPLC/拉曼分析相对快速、选择性强且灵敏，并且可以收集信息丰富的多变量数据。
HPLC/拉曼系统的实验设置如图 1 所示。拉曼光谱是使用 Kaiser Optical Systems Hololab 系列 5000 拉曼仪器收集的，该仪器由 Holoprobe 透射全息摄谱仪与无限远校正光纤耦合显微镜连接。拉曼系统配备了 785 nm 稳定外腔二极管激光器 (SDL Inc.)，在样品上运行的平均功率为 60 mW。拉曼探头和显微镜物镜之间的准直空间中的分束器提供拉曼流动池中波导管的实时视觉图像，以促进激光对准。拉曼探头通过一根 8 微米直径的单模激发光纤与显微镜耦合，散射信号则通过一根 100 微米直径的多模光纤收集。40×（0.65 NA）物镜用于聚焦激光并收集落射照明配置中的散射辐射。选择 40 倍物镜是因为其数值孔径较大，这有助于在动态流动测量过程中保持波导拉曼散射辐射的完整收集。所有拉曼光谱均使用 50 µm 狭缝宽度和 -40℃ 的探测器温度收集。
图 1. 高效液相色谱(HPLC)/拉曼波导检测器装置示意图。
拉曼波导探测器。设计了一种新型流动池，并针对对流动液体样品进行敏感拉曼测量进行了优化（图2）。该池由一段聚合物波导管和一个与典型显微镜玻片相同尺寸（3英寸×1.5英寸）的不锈钢块组成，以便在显微镜平台上使用。该池的底部配有三个流体口：一个用于废液排出，另一个用于排除气泡，第三个中心口用于连接液芯波导。这三个口在池的表面通过一个切割在FEP氟聚合物垫片上的通道连接在一起。垫片的通道尺寸为20×1.6×0.25毫米（长×宽×深）。垫片放置在不锈钢顶板和基座之间，形成密封的液体池。然后，在中心口上方固定了一个直径为25毫米、厚度为250微米的熔融硅窗，以便光学器件可以进入液芯波导。拉曼波导探测器腔直接与显微镜平台连接，并通过平台下方进行流体连接。一旦探测器腔在显微镜上被固定和对准，激发激光通过显微镜物镜通过熔融硅窗口聚焦到波导管的内孔中，以全反射照明的方式进行。样品从远离端口的一端被注入波导中，并向激光流动，然后通过垫片中的通道排出到废物中。
拉曼波导探测器由聚Teflon AF管材制成。该管道材料在200至2000纳米范围内具有透明性，可以在（东莞市富临塑胶原料有限公司）购买各种内径的管道。在拉曼波导探测器中使用的液芯波导长度为1米，核心直径为50微米。液芯波导的总体积为1.9微升。选择50微米的核心直径有两个基本原因。首先，它与拉曼探针中收集光纤的直径光学匹配最佳，从而最大程度地增加了信号收集。其次，它与微孔或小孔高效液相色谱实验的洗脱体积兼容。为了进一步稳定波导的光学特性，将管道卷绕并铸造成聚合物盘，保持恒定的弯曲半径为1.9厘米，以保护免受外部环境的影响，并减少因弯曲半径变化而产生的光学效应。
液相色谱系统。高效液相色谱（HPLC）系统由Isco SFC-500注射泵、10端口进样阀和Brownlee Cyano Spheri-5柱组成。柱子规格为100×2.1毫米，氰丙基固定相与 5 µm 二氧化硅颗粒结合（色谱柱的死体积约为 175 微升）。色谱柱与一个 2 微米柱前过滤器串联使用，以去除可能堵塞波导的任何颗粒物。流动相为去离子水（Milli-Q系统），流速为50-80微升/分。流动注射分析使用了10微升的样品注射环，HPLC/Raman分离则使用了6微升的注射环。这些实验中使用的所有分析物均为分析级，在图6c中列出。之所以选择氰丙基固定相，是因为它已被证明在常温下使用水流动相快速高效地分离芳香族和脂肪族醇类物质时特别有效。 在反相HPLC中采用100%水流动相的技术是一种新兴技术，因为它能减少化学废物、增强检测能力并扩展HPLC的适用性。请注意，所选择的分析物和HPLC条件仅用于演示目的，HPLC/Raman系统对许多反相流动相具有广泛适用性，例如甲醇/水和乙腈/水。与纯水流动相相比，使用有机改性剂实际上可以提高高效液相色谱/拉曼分析的性能。为了达到效果，流动相的拉曼光谱不能干扰相关分析物的拉曼光谱，因为流动相的光谱强度将占主导地位。
此外，还为拉曼波导检测器选择了 1 米长的特氟隆 AF 管，以最大限度地增加检测池路径长度，同时不引入色谱谱带展宽。1.9微升 的检测体积与该系统的峰宽体积相匹配，其范围为 35（甲醇）至 185微升（苯甲醇）。无论是体积效应还是Teflon AF 管的保留效应，都不会导致峰带增宽。
为了说明使用拉曼波导探测器所实现的信号增强效果，图 3 显示了 10%异丙醇（IPA）水溶液的两个拉曼光谱。图 3a 所示的 IPA 拉曼光谱强度较高，是在流动注射分析（FIA）条件下，在 1m × 50微米内径的Teflon AF波导中采集的。在 FIA 模式下，一个 10µL 的样品塞以 50µL/min 的恒定速率注入水流动相中。图3b显示的较低强度的IPA光谱是通过放置在1厘米内径玻璃瓶上方的熔融石英盖片上垂直收集的，以再现相同的取样条件。图3中的两个光谱均是通过相同的显微镜激发和收集光学装置进行4秒积分得到的。请注意两个光谱的不同纵向刻度。在817 cm^(-1)（C-C-O同相伸展）处的强烈拉曼峰被用来评估拉曼波导池与瓶子测量的性能。波导池中 10% IPA 光谱的拉曼信号强度比小瓶中收集的光谱大大增强。在去除由水和熔融石英窗口引起的拉曼散射后，计算了817 cm^(-1)处拉曼峰的强度。对图 3 中的两个光谱进行比较后发现，小瓶光谱的所有特征在波导光谱中都存在并得到了增强。请注意，波导光谱中也没有来自Teflon AF管道的无关峰值。当激光正确发射到波导的芯部时，从Teflon AF波导包层收集到的拉曼散射极少。
图 3. (a) 10% IPA 在 a1m × 50 µm 内径拉曼波导检测器中的拉曼光谱；（插图）同一波导中 10 ppm IPA 的拉曼光谱 (S/N ) 4.1)；(b) 玻璃瓶中 10% IPA 的拉曼光谱；（插图）小瓶中 1% IPA 的拉曼光谱 (S/N) 3.2)
图 3 中的插图光谱显示，在 600 至 1200 cm^(-1)之间，小瓶和波导都检测到了接近 LOD 的 IPA 光谱。图 3a 中的插图光谱是 10 ppm IPA 水溶液在 1 m × 50 µm 直径波导检测器中进行 4 秒积分的结果。计算得出的 10 ppm IPA 光谱的信噪比（S/N）为 4.1，其中噪声定义为 630 至 680 cm^(-1)之间平均值标准偏差的三倍。图 3b 中的插图光谱是对小瓶中 1% IPA 进行 4 秒积分的结果。计算得到的1% IPA光谱的S/N为3.2。请注意，与典型的小瓶测量相比，在拉曼波导池中进行测量的检测限提高了 1000 多倍。插图光谱中的倾斜背景和负信号强度是由于水背景的去除造成的。
图4显示了在浓度从10^(-3)到10%（v/v）范围内的IPA水溶液的校准曲线。这些数据是在与图 3 相同的 FIA 条件下获得的。使用817 cm^(-1)的IPA拉曼峰强度进行校准。曲线上的每个点都是 4 秒钟累积的结果。校准曲线在这个大动态范围内呈线性关系；然而，仔细观察会发现，在较低浓度下，曲线的斜率有所减小。导致波导中非线性的一些现象包括激光激发的近红外吸收（由水引起）以及移动相或样品对拉曼散射辐射的吸收。因此，不能简单地从高浓度信号外推来推断浓度检测限可能是多少。因此，根据公式LOD = 3σ/m计算LOD，其中σ是630至680 cm^(-1)之间均值附近噪声的标准差，m是校准曲线在低浓度范围的斜率。在1米×50微米内径波导中，使用785 nm激发（60 mW）在水中的IPA的LOD确定为2 ppm。这个浓度检测限可以直接应用于HPLC检测，下面将对此进行演示。
图4. 2-丙醇校准曲线，显示经过背景校正后的817-cm^(-1)拉曼峰强度与水中IPA浓度（v/v %）之间的关系（浓度范围1×10^(-3)至10%）。这些光谱是使用1米×50微米内径拉曼波导探测器获取的。
用于 HPLC 的拉曼波导检测器的性能如图 5 所示，该图显示了注入 1% 的甲醇、乙醇、2-丙醇和溶解在水中的 1-丙醇的混合物获得的 HPLC/拉曼色谱图。图 5a 显示了检测器处浓度约为 1000 ppm 的四种醇的三维 (3D) 拉曼色谱图。图 5b 显示了与图 5a 相同的数据，但为了清晰起见，以地形等高线图格式呈现。等值线图将信号强度的变化显示为一系列间隔更紧密的线条；线之间的间距越小，拉曼信号越大。拉曼光谱沿色谱时间轴的分辨率由数据采集速率决定，一次 2 秒积分需要 4.3 秒的总采集时间。数据采集速率受到拉曼系统固有的 2.3 秒数据传输步骤的限制。四种醇的 HPLC/拉曼分析的总运行时间不到 6 分钟。图 5b 中的等值线图更清楚地展示了拉曼光谱与 HPLC 耦合的强大功能。使用拉曼检测有助于完全解析二维峰，如果仅从色谱轴观察，则会出现部分重叠，如图 5b 中 1-丙醇和 2-丙醇的情况。为了证明 HPLC/拉曼波导检测器识别重叠峰的能力，根据图 5b 中的数据计算出二维 (2D) 色谱图，如图 5c 所示。图 5c 中的色谱图是通过绘制 600 至 1200 cm^(-1) 光谱范围内每个光谱随时间变化的最大拉曼强度值来计算的。请注意，在图 5c 中，当数据以典型 HPLC 检测器格式显示时，2-丙醇和 1-丙醇峰重叠。这四种醇可能无法及时完全分离（图 5c）；但是，它们独特的光谱特征允许使用拉曼光谱进行积极识别（图 5b）。HPLC 首先在光谱分析之前通过分离步骤简化化合物的原始基质。拉曼光谱可以根据特定分析物的分子特征来识别特定分析物，从而补充了分离步骤，而无需依赖保留时间精度。所得分析快速、选择性强且灵敏，并且可以收集信息丰富的多元数据。
图 5. 四种醇（甲醇、乙醇、2-丙醇和正丙醇）的 HPLC/拉曼分析。(a) 四种醇的三维图。(b) 四种醇的等高线图；每种醇的时间洗脱位置由虚线表示。(c)根据(b)中的数据计算HPLC色谱图。峰上方的字母对应于 (b) 中所示的分析物。
为了进一步证明拉曼波导作为高效液相色谱检测器的有效性，对 10 种类似醇类的更复杂混合物进行了研究。图 6a 显示了以 0.5% 浓度注入水中的 10 种醇混合物获得的 3D HPLC/拉曼色谱图。该 HPLC/拉曼色谱图的总运行时间不到 12 分钟。在复杂的基质中，例如 10 种醇的混合物，很难从 3D 图中区分单个光谱特征（图 6a）。然而，图 6b 所示的这 10 种醇的等值线图则更容易解读。等值线图有助于识别 HPLC/ 拉曼色谱图中作为光谱和时间位置函数的单个化合物。图 6c 显示了在 FIA 模式下收集的 10 种水性醇的标准光谱，每种醇的进样浓度为 1%。从图 6c 中可以明显看出每种醇的独特分子指纹。在图 6c 中，分析物名称用字母标出，以指示该分析物在图 6b 和 d 中的位置。加入丁醇化合物是为了评估拉曼光谱在识别沿色谱时间轴共沸的化合物（即 1-丁醇和异丁醇）时的应用。图 6d 中的色谱图进一步证明了将拉曼检测与 HPLC 联用可提高时间分辨率。请注意，计算色谱图缺乏基线分辨率，尤其是 d 峰和 f-h 峰。在二维色谱图中，分别对应于 1-丁醇和异丁醇的 g 峰和 h 峰完全重叠（图 6d）。然而，由于Raman波导探测器的灵敏度增强使得即使注入浓度为0.5％，也可以识别许多较小的拉曼峰，因此可以完成共洗分析物的肯定鉴定。例如，在图6c中比较1-丁醇和异丁醇的光谱时，两种分析物的标准光谱在400-600 cm^(-1)区域和700-900 cm^(-1)区域都显示出独特的光谱特征。
图 6. 10 种醇的 HPLC/拉曼分析。(a) 以 0.5% (v/v) 注入的 10 种醇的三维图。(b) 10 种醇的等值线图；每种醇的时间洗脱位置由虚线表示。字母 a-j 与 (c) 中的标准光谱相关。(c) 以 1% (v/v) 注入的 10 种醇中每种醇的标准光谱，按照从柱中洗脱的顺序（从下到上）。(d)根据(b)中的数据计算HPLC色谱图。峰上方的字母对应于 (c) 中所示的分析物。请注意，在360秒时，有共洗物g和h（即1-丁醇和异丁醇）。
目前正在处理与拉曼波导检测使用相关的一些更基本的问题。这些研究包括分析单个光学波导，以预测和确保各个波导之间的可重复分析性能。这些测量旨在识别管芯直径的变化、管壁中的物理夹杂以及可能存在的微空隙，所有这些都会影响激发和散射辐射的波导性能。另一个问题是，由于光学匹配（折射率或数值孔径）的原因，不同的管材是否更适合特定应用。目前正在研究与激光激发波长和流动相有关的问题，以提高高效液相色谱/拉曼分析的灵敏度和选择性。
拉曼波导采样和检测技术的不断发展和优化将促进拉曼光谱在连续在线监测中的应用。高效液相色谱分离法通过将复杂混合物分离以便更容易进行识别，同时还能将荧光污染物从基质中分离出来进行分析，增加了拉曼光谱的实用性。需要进一步研究激发波长、吸收和散射现象之间的各种相互作用，以选择在液芯波导中进行拉曼测量的最佳条件。
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